NGS - Illumina

Sekvenovanie novej generácie (NGS – „next-generation sequencing“) prinieslo prelom v histórii sekvenovania. Sekvenovanie nadobudlo dve najvýraznejšie zmeny – redukcia ceny a eliminácia času sekvenovania. Vďaka svojej vysokej priepustnosti, širokej flexibilite a rýchlosti umožňuje NGS štúdium biologických systémov na vysokej úrovni a využitie pre široké možnosti aplikácií, ako napr. celogenómové sekvenovanie,  RNA sekvenovanie, targetované sekvenovanie, epigenetika a pod. Samotné sekvenačné systémy môžu poskytnúť výstup od desiatok megabáz až po tisíce gigabáz v závislosti od typu a konfigurácie prístroja.

Proces sekvenácie pozostáva zo 4 hlavných krokov:

• Príprava knižnice – mechanická/ enzymatická fragmentácia vlákien DNA a následné priradenie adaptérov k jednotlivým fragmentom DNA

• Tvorba klastrov – prichytenie jednovláknových DNA fragmentov pomocou adaptérových sekvencií na sklenenú platničku, tzv. flow cell, a následná amplifikácia jednotlivých fragmentov – bridge amplifikácia, ktorej výsledkom je mnoho kópií fragmentu DNA (klaster)
• Sekvenovanie – priradenie jednotlivých fluorescenčne značených báz k templátu a ich súčasná detekcia – SBS technológia („sequencing by synthesis“). Chybovosť eliminuje prítomnosť terminátora, ktorý bráni chybnému priradeniu báz, tým pádom je garancia hodnoty QC≥30 (1 báza z 1 000 sa priradí nesprávne). Na základe počtu použitých fluorescenčných farbív sa stretávame so 4-, 2- a 1-kanálovou chémiou

• Analýza dát – zahŕňa 3 stupne. Primárna analýza dát prebieha automaticky v samotnom systéme a obnáša zobrazovanie signálov, ich intenzity, base calling, či určenie skóre kvality. Sekundárna analýza dát môže prebiehať v samotnom systéme alebo na vzdialenom servri, napr. BaseSpace (odkaz: Software: BaseSpace). Zahŕňa alignment a detekciu variantov. Výslednú interpretáciu údajov predstavuje terciárna analýza, na ktorú môžeme využiť BaseSpace alebo softvéry tretích strán.

Porovnanie jednotlivých sekvenátorov:

Súvisiace odkazy

iSeq 100 - Illumina

Jednoduchosť a cenová dostupnosť

MiniSeq - Illumina

Vyšší výstup s cenovou dostupnosťou i pre menšie laboratóriá

MiSeq Dx - Illumina

Overený štandard s najdlhšími čítaniami a certifikátom CE-IVD

MiSeq FGx - Illumina

Certifikovaná platforma pre forenzné aplikácie

NextSeq 550 - Illumina

Spojenie aplikácií vysokapacitného sekvenovania a skenovania čipov

NextSeq 550 Dx - Illumina

Certifikovaná platforma pre vysokapacitné sekvenovanie a skenovanie čipov

NextSeq 1000/2000 - Illumina

Mnoho inovácií a väčšia flexibilita sekvenovania

NovaSeq 6000 - Illumina

Najvyšší sekvenačný výkon na trhu

Sekvenačné kity - Illumina